紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内来测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。同时也是一种是涵盖临床检验在内的价廉、快速、高灵敏度的常用定量分析方法之一。利用被测物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法，是在比色的基础上所发展起来的。紫外-可见分光光度法广泛用于金属、合金、钢铁、化工产品、生物材料、食品、临床和环境样品以及药物中微量无机物和有机物的测定。

【资料图】

描述物质分子对辐射的吸收程度随波长变化的函数关系曲线即为吸收光谱，物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化，因此能够通过测定物质在不同波长处的吸光度，来绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。

从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λ_max和最小吸收波长λ_min，随后即可通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸光度比值而鉴别物质。在用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

以下是在使用紫外-可见分光光度法时对溶剂、测定方以及仪器方面的要求及校正和检定。

使用紫外-可见分光光度法时对溶剂的要求

1.当有机溶剂含有杂原子时，通常具有很强的末端吸收。因此，要将其当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长，例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm；

2.当溶剂不纯时，可能会增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸光度；

3.溶剂和吸收池的吸光度要求在220～240nm范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。

测定时的注意事项

1.在测定时，通常需以配置供试品溶液的同批溶剂为空白对照，使用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。并且吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.3～0.7之间为宜；

2.仪器的狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带的半高宽度的1/10，否则测得的吸光度会偏低，因此选择狭缝宽度的时候，应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增大为准；

3.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，在测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量；

4.当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液的pH值和对照品溶液的pH值调成一致。

测定法含量检测一般有对照品比较法、吸收系数法、计算分光光度法以及比色法。

1.对照品比较法：按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：c_x=(A_x/A_r)c_r。式中c_x为供试品溶液的浓度；A_x为供试品溶液的吸光度；c_r为对照品溶液的浓度；A_r为对照品溶液的吸光度。

2.吸收系数法：按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。

3.计算分光光度法：计算分光光度法有多种，使用时应按各品种项下规定的方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品的测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。

4.比色法：供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区，这种测定方法称为比色法。用比色法测定时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后，以相应试剂为空白，在各品种规定的波长处测定各份溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。也可取对照品溶液与供试品溶液同时操作，显色后，以相应的试剂为空白，在各品种规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度，按对照品比较法计算供试品溶液的浓度。

使用紫外-可见分光光度法的仪器校正及检定

1. 波长：由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。仪器波长的允许误差为：紫外光区±lnm，500nm附近±2nm。

(1)常用汞灯中的较强谱线237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm与576.96nm；

(2)用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正；

(3)钬玻璃在波长279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm与637.5nm处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，需注意钬玻璃会因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化；

(4)高氯酸钬溶液校正双光束仪器以10%高氯酸溶液为溶剂，配制含氧化钬(Ho2O3)4%的溶液，该溶液的吸收峰波长为241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

2.吸光度的准确度：可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合表中的规定。

3.杂散光的检查：可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。

关键词： 分光光度法 吸收系数 不得超过